دامپزشکی

Backman     (1986) برای  اولین  بار استفاده  از این  نشانگر را مطرح  نمود. كاربردهای  مهم همچون  نقشه یابی  و دستكاری  مكانهای  ژنهای  كنترل  كننده  صفات  كمی  با استفاده  ازRFLPدر سال 1983 توسطBackman  وSoller بیان  گردید. با گسترش  كاربرد این  نشانگر قدرتمند چند ژن  یا ژنوم آنالیز شدند تعدادی  از گونه های  دام  چون  گاو، گوسفند، بز، اسب، خوك  و جوجه  نیز با استفاده  از این نشانگر آنالیز شدند
كلیات  تكنیك 
    مشخص  شده  است  كه  ژنوم  موجودات  به  طور طبیعی  دارای  تفاوتهائی  در ردیف  بازهای  خطی می باشند این  تغییرات  طبیعی  كه  سبب  گوناگونی  در افراد یك  جمعیت  می شود چند شكلی  ژنتیكی نام  دارد. اگر این  چند شكلی  در ردیف  بازهایDNA  در جایگاه  شناسائی  آنزیم  محدودكننده  ایجادشده  باشند به  راحتی  قابل  ردیابی  استRFLP . وجود الگوهای  غیریكسان  است  كه  بر اثر هضم آنزیمی  یك  ناحیهِ خاص  ازDNA بوسیلهِ آنزیمهای  محدود كننده  مشخص  می شود. این  الگوهای غیریكسان  به  علت  تفاوتDNA  بسته  به  حضور یا عدم  حضور جایگاه  آنزیمهای  محدود كننده بوجود می آید این  الگوها را به  دو شكل  می توان  مشخص  كرد .
- هضم  آنزیمی  و سپس  الكتروفوز و استفاده  از لكه گذاری  سادرن 
PCR فطعه  مورد نظر و هضم  آنزیمیRFLP     مستقیما روی  تظاهر ژن  از طریق  تغییر در شكل گیریmRNA  و میزان  و تعداد نسخه برداری  تاثیر می گذارد.

آنزیمهای  محدودگر
    آنزیمهای  برشی  دسته ای  از آنزیمهای  آندو نوكلئاز به  شمار می روند كه  یك  ردیف  اختصاصی از بازها را در درون  مولكولDNA  دو رشته ای  شناسائی  می كنند .
    در سال  1970 سویه های  معینی  از باكتری  كه  قادرندDNA خارجی  را كه  وارد سلول  آن شده  تجزیه  كنند، كشف  گردید. چون  با این  آنزیمها، سویه های  ویژه ای  از باكتری  قادر بودند كه  آلوده كنندگی  فاژ یا ویروس  را كاهش  دهند و در واقع  زمان  میزبانی  باكتری  را محدود كنند به  اسم  آنزیم محدودگر نامیده  می شذتد. به  دلیل  اهمیت  این  پدیده  و نقش  كلیدی  آن  در پیشرفت  ملكولی  كاشفین این  آنزیمهای  محدودگر سه  نفر به  اسم  آلبر(Albet) )، اسمیتSmith))  )، ناتنز (Nathan)بودند كه  موفق  به  دریافت  جایزهِ نوبل  شدند     در بیشتر مواقع  توالی  شناخته  شده  این  آنزیمها یك  پالیندروم  است  كه  معمولاإ شامل  چهار شش  جفت  باز دارای  تقارن  دو طرفی  است، یعنی  از چپ  و راست  به  یك  صورت  خوانده  می شود.
    زمانی  كه  یك  آنزیم  برشی  بهDNA  اضافه  می شودDNA از بسیاری  از مكانها كه  از آنها قبلاعنوان  سایت  برشی  یاد شد، شكاف  برمی دارد و در اصط لاح  هضم  می شود. حاصل  فرآیند هضم،تعدادی  قطعه  است،

در زیر چند مثال  از آنزیمهای  برشی  آورده  شده  است:
    در روشRFLP  ابتدا نمونه ای  ازDNAرا با یكنوع  آنزیم  برشی، هضم  می كنند كه  در نتیجه تعداد زیادی  قطعه  با طول  متفاوت  بدست  می آید، سپس  این  قطعات  با استفاده  از ژل  آگارز ازهمدیگر جدا می شوند شناسائی  وتشخیص  یك  قطعه خاص  با استفاده  از كاوشگرها امكانپذیر است كه  این  عمل  با استفاده  از تكنیك  دیگری  تحت  عنوان  لكه گذاری  سادرن  صورت  می گیرد.

پروب  یا كاوشگر
    قطعهِ خاصی  ازDNAرا كه  متعلق  به  توالی  از یك  ژن  خاص  یاcDNA می باشد، بوسیله آنزیمهای  برشی  خاص  هضم  و قطعات  حاصل  در حاملهایی  (پلاسمید) كه  توسط  همان  آنزیم محدودگر برش  داده  شده اند جاگذاری  می شود. این  پلاسمیدها جهت  تكثیر و نگهداری  به  باكتریهای آزمایشگاهی  كه  اغلب  اشریشا كلی  هستند منتقل  می شوند. كلونهای  یاد شده  توسط  رادیو ایزوتوپها یامواد شیمیایی  چون  بیوتین  نشاندار می شود. در صورت  وجود همگنی  ردیف  بازی  مشابه  بین  پروب وDNA هضم  شده  اتصال  بین  این  دو برقرار خواهد گردید.
لكه گذاریSouthern    
    برای  انجام  عمل  هیبرایداسیون  لازم  است  كه  علاوه  بر قطعه  كاوشگر، قطعاتDNA  هضم شده  نیز تك  رشته ای  شوند لذا ابتداDNA روی  ژل  آگارز كه  حاوی  قطعات  هضم  شده  است  درمحلولهای  قلیائی  مثل  اوره  یا فرمالدئید یا هیدروكسیدسدیم  تك رشته  می نمایند. سپس  صفحه ای  ازغشاء نیترو سلولزی  را روی  قسمت  فوقانی  ژل  قرار داده  و روی  آن  غشاء مقداری  كاغذ جاذبه  الرطوبه می گذارند محلول  بافر تانك  الكتروفوزر بوسیله  فشار اسمزی  كاغذ فوقانی  بالا كشیده  می شود و حین عبور از ژل  به  غشاء نیترو سلولزی  كه  دارای  بار مثبت  است  منتقل  می گردد. با تسهیل  عمل هیبریداسیون  بین  كاوشكر و قطعاتDNA  هضم  شده  در معرض  پروب  نشاندار رادیواكتیو در نقاطی كه  همولوژی  وجود دارد هیبرید می گردد. قطعاتی  كه  هیبریداسیون  در آنها صورت  نگرفته  است  ازمحیط  شسته  می شوند و سپس  از غشای  نیترو سلولزی  در مجاورت  فیلم  عكاسی  اتورادیوگرافی بعمل  می آید پس  از ظهور و ثبوت  فیلم  قطعات  ویژه ای  ازDNA كه  با پروب  هیبرید هستند به صورت  یك  باند مرئی  دیده  می شود شكل  زیر مراحل  انجام  لكه گذاریSouthern  را نشان  می دهد.

مزایایRFLP  عبارت  است  از موارد زیر می باشد:
- تحت  تاءثیر محیط  نیست  و صددرصد ژنتیكی  است 
- همبارز است 
- تكرار پذیری  آن  بالاست 
PCR-RFLP(PBR)
    در روش  دومRFLP  ، ابتدا قطعه  حاوی  جایگاه  چند شكلی  را با واكنش  زنجیرهِ پلی مراز واستفاده  از دو پرایمر مخصوص  كه  به  همین  منظور طراحی  شده  تكثیر می نمایند و پس  از هضم آنزیمی، الكتروفوز می كنند. درPBR جهشهائی  از نوع  نقطه ای  و حذف  و اضافه  كه  باعث  تغییر درسطح  قطعه  آنزیمی  می گردند قابل  تشخیص  است 

  فرق  لكه گذاری  سادرن  وPBR
    در RFLPسادرن  تنوعDNA در داخل  یك  منطقهKb  30 محصور توسط  پروب  تعیین می گردد در حالیكه  درPBR تنوع  در داخل  منطقه ای  كه  از دو طرف  به  پرایمر ختم  شده  تعیین می شود این  ناحیه  معمولاKb2-0.5است. علاوه  بر این  درPBRمزایائی  چون  سادگی، سرعت زیاد، عدم  نیاز به  مواد رادیواكتیو و تكرارپذیری  بالا مطرح  می باشد
    میزان  پلی مورفیسم  و تعداد آللها درPBR كمترازRFLPسادرن  می باشد عباسی  (1376)نشانگرPBRبرای  تشخیص  پلی مورفیسم  در ژن  هورمون  رشد گاوهای  هلشتاین  استفاده كرد Aggrey    و همكاران  (1999) از ماركرPBR برای  تشخیص  پلی  مورفیسم  در ناحیهِ مجاور ژن  گیرنده  هورمون  رشد در گاوهای  هلشتاین  كانادا استفاده  نمودند و الگوهای  باندی  مختلفی  را درروی  ژل  مشخص  نمودند
PCR-SSCP
    این  روش  در سال  9891 ابداع  شد. زمانی  كهDNA دو رشته ای  در روی  ژل  الكتروفوز حركت داده  می شود. حركتDNA  به  اندازه  قطعه  بستگی  دارد بطوریكه  مولكولهای  كوچك  از منافذ ژل  به آسانی  عبور می كنند. در الكتروفوزSSCPابتدا از یك  مادهِ دناتوره  كننده  (واسرشت  كننده) مانند اوره برای  تبدیلDNA  دو رشته ای  به  تك  رشته ای  استفاده  می شود.
    در هنگام  راندنDNA  تك  رشته  در ژل، اثر متقابل  داخل  مولكولی  روی  می دهد. به  عبارت دیگرDNA رشته  قادر است  در بخشهائی  با خود باند تشكیل  دهد بنابراین  حركت  مولكولها دراین  حالت  بیشتر به  ساختار مولكولیDNA  تك  رشته  نیز وابسته  است  (ساختمان  سوم)
    ساختمان  سوم  در قطعه  تك  رشته  وابسته  به  توالی  كل  قطعه  است  اگر جهش  در توالیA  رخ  دهد ساختار قطعه  تغییر می یابد. اگر پلی  مورفیسم  در قسمت  آغازین  محصولPCR  باشدشناسائی  آن  باSSCP بسیار راحت تر است.

PCR-DGGE
DGGE     یكی  از روشهای  مناسب  برای  آشكار سازی  جهشها است. این  روش  بررسی فرآورده های  زنجیره  پلی مراز صورت  می گیرد. در صورتیكه  قطعات  رشتهDNA  در یك  نوكلئوتید باهم  متفاوت  باشند، الگوی  واسرشت  شده  متفاوتی  را نشان  می دهند. در این  روش  دو نمونهDNA  دردو ستون  جداگانه  از یك  ژل  پلی اكریلامید كه  دارای  نسبتی  از غلظت  ماده  واسرشت  كننده  (معمولافرمامید) است، مورد الكتروفورز قرار می گیرد. وقتی  مولكولها به  سطح  بحرانی  دناتوره  می رسند، دورشتهDNA  شروع  به  جدا شدن  می كنند در این  حالت  كاهش  معنی داری  در حركت  قطعات  ایجادمی شود. این  نقطه  به  عنوان  نقطه  ذوب  عمل  می كند و باعث  تاءخیر در حركت  مولكولDNA  جهش یافته  نسبت  به  فرم  وحشی  می گردد
DGGE     به  مواد رادیواكتیو و مواد شیمیائی  سمی  احتیاج  ندارد ولی  ابزار پیشرفته می خواهد درصد تعیین  موتاسیون  در این  روش  خیلی  نزدیك  به  100% است. نوع  مشابه ای  از این روشTGGEمی باشد كه  در آن  از حرارت  بجای  غلظت  مواد شیمیائی  در ژل  استفاده  می شود. شكلهای  پیوست  چگونگی  انجام  تكنیكDGGE  را نشان  می دهد.    بهترین  طول  قطعات  برایDGGE  بینbp  150-1500می باشد. برای  واسرشت  شدن  كامل قطعات  حاصل  از زنجیرهِ پلی مراز از یك  ناحیه  حاوی  بالاترین  دمای  ذوب  مصنوعی  به  نام GC-clamp استفاده  می شود نمونه ای  از استفاده  از ماركرDGGEرای  یافتن  پلی  مورفیسم  دراگزون  ده  گیرندهِ هورمون  رشد توسط  جیGe و همكاران  (1999) انجام  شده  است 

PCR-ARMS
    روشARMS  روش  سریعی  برای  تعیین  جهشهای  نقطه ای  و حذف  و اضافه ها است. این  روش  اولین  بار توسطNewton  و)Groham 1994 (برای  آنالیز بازهای  متفاوت  دروالدین  حاوی  كمبود آنتی ترپیسین  و همچنین  برای  تشخیص  والدین  ناقل  بیماری  سیستیك فیبروزیس  و بتاتالاسمی  بكار گرفته  شد.
    این  تكنیك  براساس  طراحی  پرایمرهای  اختصاصی  آللها درPCRمی باشد. برای  تشخیص یك  جهش  ویژه، دو پرایمر كنترل  در نزدیكی  محل  موتاسیون  برای  اطمینان  از عمل  صحیحPCR  طراحی  می شود. برای  تكثیر منطقهِ حاوی  جهش  نیز یك  پرایمر مشترك  برای  الل  موتانت  و وحشی طراحی می گردد. دو پرایمر باقی  مانده  همان  پرایمرهایARMS  می باشد كه  باز َ3 آنها به ترتیب  مكمل  توالی  الل  موتانت  و الل  وحشی  هستند. چنانچه  پرایمرARMSدارای  َ3 مكملDNA  الگو بود، همراه  با پرایمر مشترك  قطعه  ما بین  دو پرایمر تكثیر می گردد و ما در روی  ژل  دو باند رامشاهده  می نمائیم.
    اگر پرایمرARMSدارای  َ3 مكملDNA  الگو نبود، فقط  یك  باند در روی  ژل  كه  حاصل  تكثیرمنطقه  بین  دو پرایمر كنترل  می باشد، مشاهده  می گردد. زیرا انتهای  َ3 ناجور جفت  شدگی  دارد وباعث  جلوگیری  از عمل  پلی  مراز به  جهت  دور شدن  َ3 آغازگر ازDNA می شود آقائی (1376) اولین  بار در ایران  از این  نشانگر برای  شناسائی  جهشهای  ژن  كاپاكازئین  در گاوهای  بومی ایران  استفاده  نمودند

AFLP
Zabeau     و همكاران  (1993) روش  جدیدی  را تحت  عنوان  تكثیر قطعات  برش  یافتهِ انتخاب ابداع  كردند كه  حاصل  آنAFLP  است. این  روش  تركیبی  ازPCR وRFLPمی باشد. درسال 1995،Vosو همكاران  از این  روش  برای  انگشت  نگاری  ژنومهائی  كه  از لحاظ  چند شكلی  در طول قطعات  حاصل  از هضم، بسیار بهم  نزدیك  بودند استفاده  نمودند

مزایایAFLP  
نیاز به  پروب  ندارد
دمای  اتصال  پرایمر به  الگو بسیار بالاست 
معمولا غالب  است  و زمانی  همبارز است  كه  سایت  برشی  پلی  مورفیك  كاملا داخل  قطعه باشد
ریزماهواره ها
    واژه  ریزماهوار در سال  1985 بوسیلهJeffery  مطرح  گردید و مفهوم  آن  توالیهای  كوتاه  تكرارشونده  در ژنوم  موجودات  می باشد. ریزماهواره ها توزیع  وسیعی  را در اكثر گونه های  مهره داران  به خود اختصاص  داده اند معمولترین  تكرارها در ژنوم  پستانداران، تكرارهای  دو نوكلئوتیدی CA)n و(CT)n وdG - dT)n ) می باشد.
    تعداد باز موجود در هر ردیف  تكرار شونده  ممكن  است  دو، سه، چهار یا حتی  بیشتر با برای  طراحی  پرایمر از خود این  نوكلئوتیدهای  تكراری  استفاده  می شود.
    كاربرد میكروساتلیتها به  عنوان  آغازگر اولین  بار توسط  لیكفدت  و همكاران  بحث  شده  است چون  میكروساتلیت ها چند شكلی  بالائی  دارند می توانند به  آسانی  درPCRردیابی  شوند.     نقشه یابی  ژن  با این  ماركر در گونه هائی  مانند گاو كه  بیش  از 400میكروساتلیت  شناخته  شدهدارد، سریعتر صورت  خواهد گرفت    در حالی  كه  هر دو الل  یك  مكان  ژنی  را می توان  باRFLPمورد تجزیه  قرار داد، در میكروساتلیت بندرت  می توان  تعیین  كرد یك  قطعه  خاص  در حالت  هموزیگوت  یا هتروزیگوت  بوجود آمده  است.
از میكروساتلیت  برای  كشف  اشتباهات  موجود در ثبت  والدین  برای  نتاج  در مراكز اصلاح  نژاداستفاده  می شود و در پیش بینی  ارزشها اصلاحی  بكار گرفته  می شود. بعضی  از مشكلات  استفاده  ازماهواركها به  شرح  زیر است.

    عملیات  شناسائی  ریز ماهواره ها، تعیین  توالی  بازی  آنها و طراحی  و ساخت  آغازگرها
تهیه  نقشه  ژنتیكی  بسیار پیچیده  بوده  و مستلزم  صرف  وقت  و هزینه  فوق العاده  است.
    به  علت  پلی مورفیسم  زیادتر از حد ریز ماهواره ها كاربرد آنها فقط  در رده بندی های  درون گونه ای  پیشنهاد می گردد Lucy و همكاران  (1998) از این  ماركر برای  بررسی  پلی مورفیسم  در ناحیه  پیش بر(پروموتور) ژن  گیرندهِ هورمون  رشد استفاده  نمودند
STS وALP
    وجود اختلاف  در اندازهِ قطعات  حاصل  ازPCR كه  در آن  دو پرایمر هدفمند از توالی  ژن بكار رفته  است  راALP گویند. این  اختلاف  بیانگر وقوع  پدیده  حذف  یا اضافه  شدن  این  نشانگراست  كه  اولین  بار بوسیله Olson  (1989) مطرح  گردید.    برای  مشاهده  پلی  مورفیسم  از نوع  حذف  و اضافه  در ALP لازم  است  كه  حداقل  10 جفت  بازدر این  نوع  جهش  شركت  داشته  باشند.

نشانگرRAPD
    در سال  1990 دو گروه  تحقیقاتی  همزمان  روشی  را برای  سنجش  میزان  چند شكلی ابداع  كردند یك  گروه  در شركت  دوپونت كه  روش  خود راRAPD نامیدند و گروه  دیگر در موِسسه تحقیقات  زیست  شناسی  كالیفرنیا كه  روش  خود را واكنش  زنجیرهِ پلی  مراز با پرایمر تصادفی Arbitrarily Primed PCR نامیدند.    در این  روش  یك  آغازگر چند نوكلئوتیدی  كوتاه  كه  بطور تصادفی  از توالیهای  بازیA  انتخاب  شده  است  در مجاور سایر مواد لازم  برای  تكثیر درPCR قرار می گیرد. در این  تكنیك  چندشكلی هایDNA  یا از اختلافات  موجود در توالیDNA  در مكانهای  اتصال  آغازگر یا از طریق دگرگونیهائی  كه  در اثر اضافه  شدن  و حذف  و انورسیون  در نواحی  تكثیر شده  روی  داده  است مشاهده  می گردد.      اگر مكانهای  اتصال  آغازگر روی  دو رشته  الگو، در فاصلهِ مناسبی  قرار گرفته  باشند،DNA پلیمراز قادر به  طی  كردن  فاصله  دو پرایمر اتصالی  خواهد بود. در این  روش  بطور كلی  ازآغازگرهائی  با طول  9-10نوكلئوتید با حداقل  محتوای  50 GC%استفاده  می شود.
    ماركرRAPDیك  ماركر غالب  است  و در آن  ژنوتیپ  افراد هتروزیگوت  رانمی توان  تشخیص داد. این  مسئله  باعث  كم  ارزش  شدن  آن  درF2شده  است      كاربردRAPDدرگونه های⠠?? پستاندار محدوداست  وكمتر درمطالعات  حیوانی  استفاده  می شودعلاوه بر غالبیت، دمای  اتصال  پایین  به  علت  كوتاهی  پرایمرها احتمال  وقوع  اتصالات  اشتباهی  را بالامی برد. میرحسینی  و همكاران  (1374) از ماركرRAPDبرای  تعیین  چند شكلی  در لاین های  كرم ابریشم  ایران  استفاده نمود
    آزادی  (1378) با استفاده  از این  ماركر فاصله  ژنتیكی  پنج  نژاد گوسفند ایرانی  را بررسیكرد (3). ولی الهی  و همكاران  (1379) ازماركرRAPD اولین  بار برای  مطالعه  گونه ای  برخی  باربوس ماهیان  ایران  استفاده  نمودند

DAF
    در سال  1991 این  تكنیك  توسطCaetano-Anolles  پیشنهاد شده  است. این  نشانگر از نظراصول  مشابه  با روشRAPD  می باشد و تفاوتهای  آن  با روشRAPD  در طول  آغازگر، سیكل حرارت  مورد استفاده  درPCR ، نوع  ژل  و رنگ  آمیزی  می باشد.

SCAR
Michelmore     و همكاران  (1993) نوع  جدیدی  از نشانگرهای  مولكولی  را كه  از روش RAPD مشتق  شده  بود و مشكلات  مربوط  به  آنها را نداشت  ابداع  نمودند.    در این  روش  قطعات  حاصل  ازRAPDرا كلون  و تعیین  توالی  می كنند و در مرحله  بعد آغاز24وكلئوتیدی  را كه  مكمل  انتهای  قطعهِ توالی  یابی  شده  می باشد را طراحی  می نمایند. وقتی  این آغازگر باDNA الگوی  اصلی  درPCRبه  كار رود یك  مقرر ژنی  كه  اصط لاحاإ اسكار(SCAR)نامیده می شود تكثیر می شود

منبع: آرش جوانمرد. بررسی چند شکلی ناحیه پروموتور ژن گیرنده هورمون رشد در گاوهای سیستانی. پایان نامه کارشناسی ارشد- دانشگاه تهران