هما نند سازی DNA

مقدمه

پیشرفتهایی که در سده اخیر نصیب علم ژنتیک شده است، تا حدود زیادی مرهون مطالعه و بررسی وراثت در باکتریها است. امروزه ثابت شده است که مکانیسمها ژنتیکی در باکتریها از نظر واکنشهای شیمیایی مشابه یاخته‌های یوکاریوت است. پروکاریوتها موجودات ساده و مناسبی برای بررسیهای ژنتیکی هستند. زیرا در آنها تنها یک مولکول DNA در هر یاخته وجود دارد و این DNA دارای ساختار کروموزمی پیچیده‌ای نیست. استفاده از میکروبها به عنوان ابزار مطالعه ژنتیکی دارای نقاط ضعفی نیز است.

اول آنکه کوچکی اندازه این موجودات بررسی ویژگیهای ظاهری هر یاخته را دشوار می‌سازد. دوم آنکه تولید مثل جنسی در این موجودات وجود ندارد و یا بطور ناقص دیده می‌شود. پس از اینکه ساختار مولکولی DNA که نخستین بار بوسیله واتسون و کریک معرفی و ارائه شد، نحوه بیوسنتز آن را نیز در یاخته مشخص کردند. در اواخر سالهای 1950 ، کریک اصل بنیادی را مطرح کرد. این اصل بیان کننده چگونگی انتقال اطلاعات ژنتیکی از مولکول DNA به RNA و ترجمه آن در پروتئینها است.

همانندسازی DNA

در مطالعات اولیه برای همانندسازی سه الگو مطرح شد که شامل الگوهای حفاظتی ، نیمه حفاظتی ، پراکنده است. در الگوی حفاظتی از روی مارپیچ دو رشته‌ای DNA ، یک مولکول کامل DNA ساخته می‌شود. در الگوی نیمه حفاظتی ابتدا دو رشته DNA از هم باز شده و در مقابل هر یک از رشته‌ها ، رشته مکمل ساخته می‌شود.

در الگوی پراکنده ابتدا مولکول DNA به قطعاتی تبدیل می‌گردد و هر یک از قطعه رشته مکمل خود را سنتز می‌کند. واتسون و کریک با پژوهش‌های خود بر روی مولکول DNA ، الگوی نیمه حفاظتی را منطقی و تنها راه همانند سازی می‌دانستند. سپس مزلسون و استال با انجام آزمایشهای بسیار ظریف و مهم ، درستی چنین الگویی را به اثبات رساندند.

 آزمایش مزلسون و استال

مزلسون و استال برای اثبات فرآیند همانند سازی آزمایشی انجام دادند که به شرح زیر می‌باشد. آنها ابتدا یاخته‌های باکتری از گونه اشریشیاکلی را در محیط کشت ویژه‌ای که نیتروژن آن از نوع سنگین (N15) بود، برای زمان معین کشت دادند و .....

ادامه نوشته

وش های تغییر یافته PCR

از آنجا كه زنجيره‌هاي تازه ساخته شده خود مكمل پرايمرها است، اين چرخه مي‌تواند پس از يك مرحله واسرشته شدن زنجيره‌هاي ‏DNA‏ از هم تكرار شود. به عبارتي ‏PCR‏ روشي است براي يك برنامه دوره‌اي مشتمل براي تكرار گرم و سرد كردن و ‏DNA‏ به‌كمك يك آنزيم ‏DNA‏ پليمراز مقاوم به گرما و يك جفت پرايمر تحت تكثير انتخابي قرار مي‌گيرد و از طريق اين روش ‏DNA‏ به صورت تصاعد هندسي زياد مي‌شود. امروزه روش ‏PCR‏ جايگاه بسيار مهمي را در جنبه‌هاي مختلف مهندسي ژنتيك، بيولوژي مولكولي، ميكروب‌شناسي تشخيصي تشخيص سرطان و بيماري‌هاي ژنتيك، تشخيص هويت، جرم شناسي (پزشكي قانوني جهت تشخيص منشأ نمونه اسپرم، خون و ...) تعيين ترادف، باستان‌شناسي، مطالعات تكاملي موجودات و ... پيدا كرده است. كاربرد بيشتر و دقيق‌تر تكنيك ‏PCR‏ در تشخيص، روش‌هاي تغيير يافته‌اي از آن به وجود آمده است كه به تعدادي از آنها اشاره مي‌شود.

مالتيپلكس پي سي آر (‏Multiplex-PCR‏)‏
‏ يكي از روش‌هاي تغييريافته ‏PCR‏ است كه در آن تنها يك جايگاه ژني مورد بررسي قرار مي‌گيرد، با استفاده از پرايمرهاي مختلف مي‌توان چندين جايگاه را مورد بررسي قرار داد و از چندين جفت پرايمر اختصاصي جهت تكثير استفاده مي‌شود. كاربردهاي اين روش مي‌تواند شامل موارد زير باشد: ‏
‏1) بخش‌هاي بزرگي از يك ‏DNA‏ (هدف)، جهت جست‌وجوي تغييرات مي‌تواند بررسي شود. براي مثال كشف نقص‌ها در بيماري ديستروفي عضلاني روشن يا كشف بخش‌هاي مختلف ‏IS6110‎‏ و ‏IS986‎‏ در مايكروباكتريوم توبر كلوزيس عامل بيماري سل، ‏
‏2) بخش‌هاي غيرمربوط به هم در ژنوم هدف مي‌تواند مورد آزمايش واقع شود و‏
‏3) مي‌توان از طريق اين روش با پرايمرهاي مختلف به جست‌وجوي عوامل مختلف پرداخت، مانند شناسايي عوامل شايع مننژيت. اين روش بيشتر براي شناسايي جايگاه‌هايي از ژن‌ها به كار مي‌رود كه انواع زيادي از جهش در آنها به وقوع مي‌پيوندد.

 

ادامه نوشته

معرفي انواع نشانگرهاي DNA

تاریخچه RFLP  
RFLP     اولین  بار در سال  1974 به  عنوان  یك  ماركر ژنتیكی  توسطGrodzicker  و همكاران برای  تعیین  جهش  در ویروس  به  كار گرفته  شد. استفاده  ازRFLPبه  عنوان  ماركر بیماری  ژنتیكی اولین  بار توسطKon  و Dozy (1974) برای  آنالیز بیماری  كم  خونی  داسی  شكل  به  كار گرفته  شد.Botstein و همكاران  1980تئوری  پایه  این  روش  را برای  نقشه یابی  ژنهای  مرتبط  با بیماری  درانسان  مطرح  كردند. Southern روش  انتقال  الگویDNA  و پروب  (كاوشگر) از ژل  به غشاء نیتروسلولزی  درRFLPرا ابداع  كرد. 

ادامه نوشته

معرفي انواع نشانگرهاي DNA

تاریخچه RFLP  
RFLP     اولین  بار در سال  1974 به  عنوان  یك  ماركر ژنتیكی  توسطGrodzicker  و همكاران برای  تعیین  جهش  در ویروس  به  كار گرفته  شد. استفاده  ازRFLPبه  عنوان  ماركر بیماری  ژنتیكی اولین  بار توسطKon  و Dozy (1974) برای  آنالیز بیماری  كم  خونی  داسی  شكل  به  كار گرفته  شد.Botstein و همكاران  1980تئوری  پایه  این  روش  را برای  نقشه یابی  ژنهای  مرتبط  با بیماری  درانسان  مطرح  كردند. Southern روش  انتقال  الگویDNA  و پروب  (كاوشگر) از ژل  به غشاء نیتروسلولزی  درRFLPرا ابداع  كرد. 

ادامه نوشته

PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز چیست؟

اين تکنِِيک در اواسط دهه ی 1980 بوسيله ی کری موليس معرفی شد . به دليل کاربردها و مزيت های بسيار زياد آن به سرعت در زيست شناسی مولکولی گسترش پيدا کرد . امروزه اين روش تقريباً در تمامی آزمايشگاهها ی زيست مولکولی جزو کارهای متداول می باشد و به صورت اتوماتيک بوسيله ی کامپيوتر انجام می شود.

ادامه نوشته

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

در بیولوژی مولکولی، واکنش زنجیره ای پلی مراز یا PCR، بمنظور تکثیر یک قطعه DNA مورد استفاده قرار میگیرد. تکنیک PCR در سال 1984 توسط کری مولیس (Kary Mullis) ارائه شده است. در این تکنیک، یک مولکول DNA میلیونها بار تکثیر میشود. در روش PCR سیکل های دمایی (Cycle) ایجاد میشود. در ابتدا با ایجاد حرارت و رساندن  دمای محلول  به نقطه ذوب DNA، دو رشته DNA از هم جدا میشوند. در مرحله بعد با کاهش دما یک آنزیم DNA پلیمراز فعال شده، عمل همانند سازی (Replication) را انجام میدهد. DNA پلیمراز آنزیمی است که با استفاده از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA)،  رشته الگو(DNAی مورد مطالعه) و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است. صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ3 در  مولکول DNAی مورد نظر هستند. بنابر این بطور اختصاصی فقط به این مولکولها متصل شوند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل میشود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف همانند سازی و تکثیر میگردد. با اعمال تغییرات دمایی بطور متوالی و برنامه ریزی شده، روند PCR تکرار گردیده و در هر مرحله DNA دو برابر میشود. بنابر این تعداد مولکولهای DNA بصورت تصاعدی و به نسبت ⁿ2 افزایش می یابد که n  تعداد سیکل های دمایی است. مثلا یک مولکول DNA، پس از 20 سیکل به 1.047.586 مولکول تکثیر میشود. در مرحله همانند سازی، برای جدا نگهداشتن دو رشته DNA، باید دمای محلول بالا باشد. بنابر این از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده میشود. اولین آنزیمی که بدین منظور مورد استفاده قرار گرفت Taq polymerase بود که از باکتری ترموس آکواتیکوس(Thermus aquaticus) بدست می آید.

ادامه نوشته

PCR واکنش زنجیره ای پلیمراز و کاربردهای آن

 

چهار نسخه از ژن مورد نظر حاصل می شود . بار ديگر سيستم گرم می شود و در اينجا هشت نسخه بوجود مي آيد ، و در مرحله ی بعد 16 نسخه و به همين صورت بطور تصاعدی تعداد نسخه های ژن ها زياد می شود .

در ابتدای طراحی PCR  از آنزيم DNA پليمراز E.coli استفاده شد ولی اين آنزيم به حرارت حساس می باشد و بنابراين پس از هر بار حرارت دادن محيط واکنش تا دمای 94 درجه ی سانتی گراد ، افزودن دوباره ی آنزيم تازه به محيط لازم بود . يکی از مهم ترين کشفيات در اين زمينه اين بود که باکتريهای چشمه های آب گرم دارای DNA پليمراز هايی هستند که نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در دمای بالا فعاليت بهتری دارند . برای مثال باکتری  Thermus  aquaticus دارای DNA پليمرازی است که در دمای 94 درجه ی سانتی گراد کاملاَ پايدار است و همچنين دمای اپتيمم عمل آن نيز 72 درجه ی سانتی گراد می باشد ، اين DNA پليمراز که بطور خلاصه Taq پليمراز ناميده می شود باعث شد که براحتی PCR به صورت اتوماتيک انجام شود و با افزودن يکبار آنزيم Taq پليمراز ديگر نيازی به اضافه کردن مجدد آن نباشد .

ادامه نوشته

hot start PCR reaction

PCR step

PCR cycle animation

نخستين حيوان داراي 15درصدسلولهاي انساني

چندی پیش دانشمندی ایرانی اولین قدم ها را برای تحقق این امر برداشت.
اين موجود گوسفندي با 15 درصد داراي سلول هاي انساني بوده و هدف از ايجاد آن پيشرفت به سمت اين دور نماست كه در آ ينده بتوان اندام حيوانات را براي پيوند زدن به انسان به كار برد.
دكتراسماعيل زنجاني استاد دانشگاه نوادا آمريكا براي كامل كردن تكنيك تزريق سلول هاي انسان بالغ به جنين گوسفند بيش ازهفت سال زمان و نزديك به 10 ميليون دلار هزينه صرف كرده است.
در اين تكنيك سلول هاي مغز استخوان انسان به جنين گوسفند تزريق مي شود پس ازبه دنيا آمدن جنين ظرف دوماه كبد ، قلب ،ريه و مغزي خواهد داشت كه داراي ميزاني از سلول هاي انساني بوده و مي توان براي پيوند استفاده شوند. موفقيت اين دانشمند ايراني كه بازتاب وسيعي در رسانه هاي جهان داشته افق جديدي در درمان بيماران نيازمندان به بافت هاي پيوندي توصيف شده است.
اگر چه علاوه بر گوسفندهاي حاصل از تحقيقات پروفسور زنجاني حيوانات ديگر داراي سلول هاي انساني نيز توليد شده اند ولي به گفته اين دانشمندايراني ميزان سلول هاي انساني گزارش شده در آ ن حيوانات بسيار اندك ( زير يك درصد) بوده و قابليت استفاده از آ نها در پيوند اعضا وجود نداشته است.

مقایسه روشهای مختلف استخراج DNA برای ژنوتایپینگ دامها با نشانگرهای PCR-RAPD و PCR-RFLP

چكیده:
امروزه برای شناسائی جهشهای موجود در سطح ژنوم پستانداران می توان از تكنیكهای مختلفی همچون روشهای مبتی بر PCR از جمله Microsatellite، SSCP، AFLP، RFLP، DGGE و ARMS استفاده نمود.

ادامه نوشته